Cdk2在皮肤淋巴瘤中的表达及统计浅析

　　 　　【摘要】 目的：探讨Cdk2在皮肤淋巴瘤中的表达及其在肿瘤的发生和发展中的作用。方法：收集武汉大学人民医院病理科2006～2009 年手术切除及活检经病理明确诊断的皮肤淋巴瘤蜡块40 例， 其中22 例MF、7 例皮肤间变性大细胞淋巴瘤、6 例其他类型的T 细胞淋巴瘤、5 例B 细胞淋巴瘤。另外20例皮肤炎症病变，包括10例银屑病、10例副银屑病。采用免疫组织化学方法观察各组组织内Cdk2的表达。利用HPIAS　2000图像分析系统测定Cdk2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：皮肤淋巴瘤中Cdk2呈高表达;癌旁组织中Cdk2呈低表达。图像分析结果显示：皮肤淋巴瘤与皮肤炎症病变之间Cdk2的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论：Cdk2异常高表达促进细胞增殖，从而在皮肤淋巴瘤发病过程中起重要作用。

　　 　　【关键词】 皮肤淋巴瘤; Cdk2; 免疫组织化学; 图像分析

　　 　　在恶性淋巴瘤与假性淋巴瘤的淋巴结外病变中， 皮肤是最常受侵犯的器官， 虽然皮肤淋巴瘤在某些方面比较特殊， 但仍属于淋巴瘤一类疾病，皮肤淋巴瘤是仅次于胃肠道的第二常见的淋巴结外淋巴瘤[1，2]。细胞周期与肿瘤发生、发展有密切关系，细胞周期的动态过程有赖于正、负调节因子控制。细胞周期素依赖性激酶(cyclin　de　pendent kinase， Cdk)在细胞分化、有丝分裂中起促进作用[3，4]。为探讨Cdk2 与皮肤淋巴瘤的发生发展的关系及临床意义，本文采用免疫组化的方法对皮肤淋巴瘤中Cdk2表达情况进行了检测，以期为皮肤淋巴瘤的早期诊断和治疗提供参考指标。

　　 　　1 材料和方法

　　 　　1.1 材料

　　 　　1.1.1 材料来源 收集武汉大学人民医院病理科2006年～2009 年手术切除及活检经病理明确诊断的皮肤淋巴瘤蜡块40 例， 其中22 例蕈样肉芽肿(MF)、7 例皮肤间变性大细胞淋巴瘤、6 例其他类型的T 细胞淋巴瘤、5 例B 细胞淋巴瘤。另外20例皮肤炎症病变，包括10例银屑病、10例副银屑病。

　　 　　1.1.2 材料分组 将所有标本进行常规HE染色，将实验分为2组: 皮肤淋巴瘤组和皮肤炎症病变组。

　　 　　1.2 方法

　　 　　1.2.1 常规脱水、透明、石蜡包埋、切片及HE染色

　　 　　1.2.2 免疫组织化学SP法检测Cdk2相关抗原

　　 　　具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白　过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检; 用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为Cdk2的阳性对照组。

　　 　　1.2.3 免疫组织化学结果判断

　　 　　Cdk2以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS　1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Cdk2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　 　　1.3 统计学处理

　　 　　数据以均数±标准差表示，用SPSS12.0软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。

　　 　　2 结果

　　 　　皮肤炎症病变组: 皮肤炎症病变内可见少量的棕黄色颗粒， Cdk2表达弱或无表达;皮肤淋巴瘤组: 皮肤淋巴瘤内可见密集分布的棕黄色颗粒，Cdk2表达强。图像分析结果显示：皮肤炎症病变组Cdk2表达的平均光密度和阳性面积率分别为0.0458±0.0015和0.0297±0.0019;皮肤淋巴瘤组Cdk2表达的平均光密度和阳性面积率分别为0.7831±0.0069和0.7436±0.0060。皮肤炎症病变组与皮肤淋巴瘤组Cdk2比较，差异有显著性意义(P<0.05)。见表1。表1 皮肤炎症病变组与皮肤淋巴瘤组Cdk2表达的平均光密度和阳性面积率

　　 　　3 讨论

　　 　　恶性淋巴瘤(ML ) 是淋巴结或结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤， 一般分霍奇金淋巴瘤(HL ) 和非霍奇金淋巴瘤(NHL ) 两大类。在恶性淋巴瘤与假性淋巴瘤的淋巴结外病变中， 皮肤是最常受侵犯的器官， 虽然皮肤淋巴瘤(Cutancous Lylmphoma，CL)在某些方面比较特殊， 但仍属于淋巴瘤一类疾病[5～7]。

　　 　　细胞周期受细胞精确和有序的调控。细胞周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(cyclin　dependent kinase，CDK)是细胞周期调控中的关键大分子。周期蛋白依赖性激酶亚型按数字命名，包括CDK2～CDK7。由于细胞分裂周期蛋白(CDC)2曾被命名为CDK1，因此CDK类排序自CDK2始。CyclinE　CDK2为细胞从G1进入S期的关键激酶复合物[8～10]。周期蛋白E与CDK2结合后，磷酸化其底物蛋白。但CyclinE　CDK2的激酶活性是受到严格调控的。DNA作为遗传物质必须被准确地复制到子代细胞中，当DNA受到损伤和出现错误时，其复制是不被允许的[11，12]。CDK2存在于整个细胞周期中，是cyclinE 的催化亚基，而cyclinE 是CDK2 的调节亚基，其与CD K2 结合形成一活性复合物并使CD K2 激活，可促使细胞由G1期进入S 期。cyclinE 过高表达使CDK2 持续激活，细胞周期调节失控而异常增生[13，14]。

　　 　　Cdk2活性增高，可以促进细胞演进、增殖、分化，是细胞周期的正调节因子。本实验结果显示: Cdk2在皮肤淋巴瘤中呈高表达，表明Cdk2在皮肤淋巴瘤的演变过程中发挥细胞周期正性调节因子的促进作用，使癌细胞恶性程度和侵袭力增加。结果表明， CDK2在皮肤淋巴瘤发病机制中的作用是肯定的。cyclinE 和CDK2 的异常表达已在多种恶性肿瘤中被报道，其中包括乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌等，其在临床上作为一种诊断及判断预后指标或联合指标， 可辅助临床工作者的诊治工作。

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　　 　　(本文内容来自于互联网)